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    免疫組化所用試劑

    2014-12-15 12:57:11      點擊:

    一、固定劑

      大多數神經激素、肽類物質為水溶性,在用于免疫細胞化學研究之前,常需固定。但肽類和蛋白質的物理、化學性質不同,因而對不同的固定方法或固定劑的反應也不盡相同。某些固定劑甚至可同時破壞和/或保護同一抗原的不同抗原決定簇。因此,在進行免疫細胞化學研究之前,很有必要了解所要研究的物質(蛋白質或肽類)的化學性質,并根據需要來選擇適宜的固定劑(或固定方法)以及改進固定條件。

      目前,免疫細胞化學研究中常用的固定劑仍為醛類固定劑,其中以甲醛類和戊二醛最為常用。在此,簡要介紹幾種目前較為常用和推薦的固定劑,以供讀者選用。

      1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.3

      試劑:多聚甲醛          40g

      0.1mol/L磷酸緩沖液        至1000ml

      配制方法:稱取40g多聚甲醛,置于三角燒瓶中,加入500800ml 0.1mol/L磷酸緩沖液(Phosphate Buffer以下簡稱PB),加熱至60℃左右,持續攪拌(或磁力攪拌)使粉末完全溶解,通常需滴加少許1n NaOH才能使溶液清亮,最后補足0.1mol/LPB1000ml,充分混勻。

      該固定劑較適于光鏡免疫細胞化學研究,最好是動物經灌注固定取材后,繼續浸泡固定224h。另外,該固定劑較為溫和,適于組織標本的較長期保存。

      2.4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉/氫氧化鈉

      試劑:A液:多聚甲醛    40g

      蒸餾水          400ml

      B液:Na2HPO4·2H2O    16.88g

      蒸餾水          300ml

      C液:NaOH         3.86g

      蒸餾水          200m

      配制方法:A液最好在500ml的三角燒瓶中配制(方法同前),至多聚甲醛完全溶解后冷卻待用。注意,在溶解多聚甲醛時,要盡量避免吸入氣體或濺入眼內。B液和C液配制好后,將B液倒入C液中,混合后再加入A液,以1n NaOH1N HCl pH調至7.27.4,最后,補充蒸餾水至1000ml充分混合,4℃冰箱保存備用。

      該固定劑適于光鏡和電鏡免疫細胞化學研究,用于免疫電鏡時,最好加入少量新鮮配制的戊二醛,使其終濃度為0.5%1%。該固定劑較溫和,適于組織的長期保存。組織標本于該固定液中,4℃冰箱保存數月仍可獲得滿意的染色效果。

      3Bouin’s液及改良Bouin’s

      試劑:飽和苦味酸

      40%甲醛     250ml

      冰醋酸      50ml

      配制方法:先將飽苦味酸過濾,加入甲醛(有沉淀者禁用),最后加入冰醋酸,混合后存于4℃冰箱中備用。冰醋酸最好在臨用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。

      該固定液為組織學、病理學常用固定劑這一,對組織的穿透力較強,固定較好,結構完整。但因偏酸(pH33.5),對抗原有一定損害,且組織收縮較明顯,故不適于組織標本的長期保存。此外,操作時,應避免吸入或與皮膚接觸。

      4Zamboni’s(Stefanini’s)

      試劑:多聚甲醛         20g

      飽和苦味酸           150ml

      Karasson-Schwlt’s PB     至1000ml

      配制方法:稱取多聚甲醛20g,加入飽和苦味酸150ml,加熱至60℃左右,持續攪拌使充分溶解、過濾、冷卻后,加Karasson-Schwlt’s PB1000ml充分混合(Karasson –Schwlt’s磷酸緩沖液的配制配制方法見后)。

      該固定液適于電鏡免疫細胞化學,對超微結構的保存較純甲醛為優,也適于光鏡免疫細胞化學研究,為實驗室常用固定劑之一。我們在應用中,常采用2.5%的多聚甲醛和30%的飽和苦味酸,以增加其對組織的穿透力和固定效果,保存更多的組織抗原。固定時間為618h。

      5PLP液  PLP液即過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液(Periodate-Lysine-paraform-aldehyde fixative

      試劑:過碘酸鈉

      賴氨酸鹽酸鹽(或鹽酸賴氨酸):

      多聚甲醛

      蒸餾水

      配制方法:

     。1)貯存液A0.1mol/L賴氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4):稱取賴氨酸鹽酸鹽1.827g溶于50ml蒸餾水中,得0.2mol/L的賴氨酸鹽酸鹽溶液,然后加入Na2HPO40.1mol/L,將pH調至7.4,補足0.1mol/LPB100ml,使賴氨酸濃度也為0.1mol/L,4℃冰箱保存,最好兩周內使用。此溶液的滲透濃度為300mOs mmol/L/kg。

     。2)貯存液B8%多聚甲醛溶液):稱8g多聚甲醛加入100ml蒸餾水中,配成8%多聚甲醛液(方法見前)。過濾后4℃冰箱保存。

     。3)臨用前,以3A液與1B液混合,再加入結晶過碘酸鈉(NaIO4),使NaIO4終濃度為2%。由于AB兩液混合,pH從約7.5降至6.2,故固定時不需再調pH值。固定時間為618h。

      該固定劑較適于富含糖類的組織,對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。其機制是借助于過碘酸氧化組織中的糖類形成醛基,通過賴氨酸的雙價氨基與醛基結合,從而與糖形成交聯。由于組織抗原絕大多數都是由蛋白質和糖兩部分構成,抗原決定簇位于蛋白部分,故該固定劑有選擇性地使糖類固定,這樣既穩定了抗原,又不影響其在組織中的位置關系。McleanNakane等認為,最佳的混合是:含0.01mol/L的過碘酸鹽、0.075mol/L的賴氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸緩沖液。

      6Karnovsky’s液(pH7.3

      試劑:多聚甲醛   30g

      25%戊二醛     80ml

      0.1mol/L PB    至1000ml

      配制方法:先將多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中,再加入戊二醛,最后加0.1mol/LPB1000ml,混勻。

      該固定劑適于電鏡免疫細胞化學,用該固定液在4℃短時固定,比在較低濃度的戊二醛中長時間固定能更好地保存組織的抗原性和細微結構。固定時最好先灌注固定,接著浸泡固定1030min,用緩沖液漂洗后即可樹酯包埋或經蔗糖溶液后用于恒冷切片。

      70.4% 對苯醌 (Parabenzoquinone

      試劑:對苯醌       4.0g

      001mol/L PBS      1 000ml

      配制方法:稱取4.0g對苯溶于1000ml 0.01mol/LPBS即可。

      對苯醌對抗原具有較好的保護作用,但對超微結構的保存有一定影響,故常與醛類固定劑混合使用。一般要求臨用前配制,且避免加熱助溶,因加熱或放置時間過長,固定液變為棕色至褐色,會使組織標本背景增加,影響觀察。此外,對苯醌有劇毒,使用時避免吸入或與皮膚接觸。

      8PFG液(Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG

      試劑:對苯醌            20g

      多聚甲醛              15g

      25%戊二醛             40ml

      0.1mol/L二甲酸鈉緩沖液      至1000ml

      配制方法:先以500ml左右的二甲酸鈉緩沖液溶解對苯醌及多聚甲醛,然后加入戊二醛,最后加入二甲酸鈉緩沖液至1000ml充分混合。

      對苯醌與戊二醛及甲醛聯合應用,即可阻止醛基對抗原的損害,又不影響超微結構的保存,故適于多種類抗原的免疫細胞化學,尤其是免疫電鏡的研究。

      9.碳二亞酰胺-戊二醛(ECD-G)液

      試劑:0.05mol/L PB  500ml

      0.01mol/L PBS     500ml

      Tris         約14g

      濃HCl         少許

      ECD          10g

      25%戊二醛      3.5ml

      配制方法:先以約500mlPB與相同體積的PBS混合,加入Tris(使其終濃度為1.4%)溶解,以濃HCl調pH7.0,再將事先稱取好的ECD和戊二醛加入混合液,振搖后計時,用pH計檢測,約23min時,pH降至6.6,再以1NNaOH4min內調pH7.0,此時,將該混合固定液加入盛有細胞(經PBS漂洗過)的器皿中,在23℃固定7min后,以PBS洗去固定液,即可進一步處理。

      ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboiimide hydrochloride],簡稱乙基-CDI,常用于多肽類激素的固定,對酶等蛋白質的固定也有良好效果。ECD單獨應用時,邊緣固定效應重,但與戊二醛、TrisPB聯合應用,效果明顯改善,細胞質仍可滲透,利用細胞中抗原的定位,超微結構保存較好。目前認為是一種用于培養細胞電鏡水平免疫細胞化學研究的很好的固定劑。

      10.四氧化鋨(鋨酸Osmic Acid, OsO4

      配制:將洗凈裝有OsO4的安瓿中加熱后,迅速投入裝有溶劑的棕色瓶中,使安瓿遇冷自破。也可用鉆石刀在安瓿上劃痕,洗凈后再放入瓶中,蓋好瓶塞,用力撞擊安瓿,待其破后加溶劑稀釋。為保證充分溶解,應在用前幾天配制。

     。12% OsO4水溶解:取OsO41g溶于重蒸水中。此液常作為儲備液,于冰箱中密封保存。

     。21% OsO4-PB

      試劑:A、2.26%    NaH2PO4·2H2O    4.15ml

       B2.52%                8.5ml

      C、5.4%     葡萄糖           5ml

      D、OsO4                   0.5g

      配制方法:先分別配好A、B、C三種液體,取A41.5mlB8.5ml混合,將pH調至7.37.4,取AB混合液45ml再與5ml C液混合即為0.12mol/L PBG。

     。31% OsO4/0.1mol/L二甲胂酸鈉緩沖液(pH7.27.4):

      試劑:2% OsO4水溶液             10ml

      0.2mol/L二甲胂酸鈉緩沖液(pH7.27.4)    10ml

      配制方法:取2%OsO4儲備液10ml與等量0.2mol/L、pH7.27.4的二甲胂酸鈉緩沖液充分混合即可。

      OsO4是電鏡研究所必需的試劑,常用于后固定。盡管OsO4主要為脂類固定劑,但也可與肽類及蛋白質起作用,形成肽-蛋白質或肽-脂交聯。過氧化物酶的反應產物經OsO4處理后,電子密度增高,適于電鏡研究。但由于OsO4的反應產物對光及電子有較明顯的吸收能力,因此在免疫細胞化學染色前常需去除,去鋨在光鏡水平常用1%的高錳酸鉀,在電鏡水平則常用H2O2來處理。

      以上介紹了目前免疫細胞化學中常用的一些固定液。關于固定液種類還很多,如70%90%的酒精、丙酮、醋酸酒精(含0.1%1%醋酸的70%90%的酒精等),這些溶液都能促使蛋白質凝固。它們最初只是光學顯微鏡通用的固定液,但在免疫細胞化學上用其它方法不成功時,也可試用?傊,掌握一個原則,免疫細胞化學中,含重金屬的固定液禁用(但Zenker-Formalin可進行短時的固定)。目前多數認為,對生物標本較好的固定措施是:用4℃Karnovsky’s液灌注固定1030min后,接著在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液中漂洗過液,這種短時冷固定處理,有助于超微結構和許多肽類抗原的保存。對其它較難保存的抗原可嘗試PFG、PLPZamboni’s液等混合固定液。

      二、緩沖液

      免疫細胞化學中應用的緩沖液種類較多,即使是同種緩沖液,其濃度、pH、離子強度等也常常不同。在此介紹幾種最常用的緩沖液的配制。

      10.2mol/L(pH7.4)磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer, PB

      試劑: NaH2PO4·2H2O

      Na2HPO4·12H2O

      配制方法:配制時,常先配制0.2mol/L NaH2PO40.2mol/LNa2HPO4,兩者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液(PB),根據需要可配制不同濃度的PBPBS。

     。10.2mol/L Na2HPO4;稱取Na2HPO4.12H2o 31.2g( NaH2PO4·H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。

     。20.2mol/L Na2HPO4:稱取NaHPO4.·12H2o 71.632g(或 Na2HPO4·7H2O 53.6g Na2HPO4·2H2o 35.6g)加重蒸水至1000ml溶解。

       (30.2mol/L pH7.4PB的配制:取19ml 0.2mol/L NaH2PO481ml 0.2mol/LNa2HPO4·12H2O,充分混合即為0.2mol/LPBpH約為7.47.5)。若pH偏高或偏低,可通過改變二者的比例來加以調整,室溫保存即可。

      20.01mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水(Phosphate Buffered Saline, PBS

      試劑:0.2mol/L PB   50ml

      NaCl          8.59g(0.15mol/L)

      重蒸水         至1000ml

      配制方法:稱取NaCl 8.59g0.2mol/LPB 50ml,加入1000ml的容量瓶中,最后加重蒸水至1000ml,充分搖勻即可。若擬配制0.02mol/LPBS,則PB量加倍即可,依此類推。

      PBPBS是免疫細胞化學實驗中最為常用的緩沖液,0.01mol/LPBS主要用于漂洗組織標本、稀釋血清等,其pH應在7.257.35之間,否則需要調整。0.1mol/LPB常用于配制固定液、蔗糖等。一般情況下,0.2mol/l PBpH值稍高些,稀釋成0.01mol/LPBS時,?蛇_到要求的pH值,若需調整pH,通常也是調PBpH。

      3Karasson –Schwlt’s磷酸鹽緩沖液

      試劑: NaH2PO4·H2O  3.31g

      Na2HPO4·7H2O     33.77g

      重蒸水         至1000ml

      配制方法:同前

      該緩沖液主要用于配制Zamboni’s固定液。

      40.5mol/L pH7.6Tris- HCl緩沖液。

      試劑:Tris(三羥甲基氨基甲烷)  60.57g

      1N HCl             約420ml

      重蒸水             至1000ml

      配制方法:先以少量重蒸水(300500ml)溶解Tris,加入HCl后,用1NHCl1NNaOHpH調至7.6,最后加重蒸水至1000ml。此液為儲備液,于4℃冰箱中保存。免疫細胞化學中常用的Tris-HCl緩沖液濃度為0.05mol/L,用時取儲備液稀釋10倍即可。

      該液主要用于配制Tris緩沖生理鹽水(TBS)、DAB顯色液。

      5Tris緩沖生理鹽水(Tris Buffered,Saline,TBS

      試劑:0.5mol/L Tris-HCl緩沖液   100ml

      NaCl               3.59g(0.15mol/L)

      重蒸水              至1000ml

      配制:先以重蒸水少許溶解NaCl,再加Tris-HCl緩沖液,最后加重蒸水至1000ml,充分搖勻使Tris終濃度為0.05mol/L。

      TBS主要用于漂洗標本,常用于免疫酶技術中。

      6Tris-TBS(PBS)

      試劑:Triton X-100       10ml(1%)3ml(0.3%)

      0.5mol/L Tris緩沖液(pH7.6)  1000ml(50ml)(0.2mol/LPB)

      NaCl              8.59g

      重蒸水             至1000ml

      配制方法:先以重蒸水少許溶解NaCl后,加入Triton X-100Tris緩沖液或(PB),最后加重蒸水至1000ml,充分搖勻。

      該液常用濃度為1%0.3%,前者主要用于漂洗標本,后者主要用于稀釋血清。

      70.1mol/LpH7.4)二甲胂酸緩沖液

      試劑:0.2mol/L二甲胂酸鈉      500ml

      0.1N HCl              28ml

      蒸餾水               至1000ml

      配制方法:先稱取二甲胂酸鈉(MW21442.8g,加蒸餾水至1000ml,使0.2mol/L的二甲胂酸鈉溶液;再取HCl 1.7ml加蒸餾水至1000ml ,配成0.1N,最后 取0.2mol/L二甲胂酸鈉溶液500ml0.1n HCl 28ml混合,加蒸餾水至1000ml,即為0.1mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液。

      8.幾種常用的不同pH值緩沖液的配制表

     。10.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.78.0

    pH

    0.2mol/L NaH2PO4(ml)

    0.2mol/L Na2HPO4(ml)

    5.7

    93.5

    6.5

    5.8

    92.0

    8.0

    5.9

    90.0

    10.0

    6.0

    87.7

    12.3

    6.1

    85.0

    15.0

    6.2

    81.5

    18.5

    6.3

    77.5

    22.5

    6.4

    73.5

    26.5

    6.5

    68.5

    31.5

    6.6

    62.5

    37.5

    6.7

    56.5

    43.5

    6.8

    51.0

    49.0

    6.9

    45.0

    55.0

    7.0

    39.0

    61.0

    7.1

    33.0

    67.0

    7.2

    28.0

    72.0

    7.3

    23.0

    67.0

    7.4

    19.0

    81.0

    7.5

    16.0

    84.0

    7.6

    13.0

    87.0

    7.7

    10.5

    89.5

    7.8

    8.5

    91.5

    7.9

    7.0

    93.0

    8.0

    5.3

    94.7

      (2)0.05mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.199.10

    pH

    0.2mol/L Tris(ml)

    0.2mol/L HCl(ml)

    H2O

    7.19

    10.0

    18.0

    12.0

    7.36

    10.0

    17.0

    13.0

    7.54

    10.0

    16.0

    14.0

    7.66

    10.0

    14.0

    15.0

    7.77

    10.0

    14.0

    16.0

    7.87

    10.0

    13.0

    17.0

    7.96

    10.0

    12.0

    18.0

    8.05

    10.0

    11.0

    19.0

    8.14

    10.0

    10.0

    20.0

    8.23

    10.0

    9.0

    21.0

    8.32

    10.0

    8.0

    22.0

    8.41

    10.0

    7.0

    23.0

    8.51

    10.0

    6.0

    24.0

    8.62

    10.0

    5.0

    25.0

    8.74

    10.0

    4.0

    26.0

    8.92

    10.0

    3.0

    27.0

    9.10

    10.0

    2.0

    28.0

      (3)0.2mol/L醋酸鹽緩沖液(pH3.65.6

    pH

    0.2mol/L醋酸(ml

    0.2mol/L醋酸鈉(ml

    3.6

    46.3

    3.7

    3.8

    44.0

    6.0

    4.0

    41.0

    9.0

    4.2

    36.8

    13.2

    4.4

    30.5

    19.5

    4.6

    25.5

    24.5

    4.8

    20.0

    30.0

    5.0

    14.8

    35.2

    5.2

    10.5

    39.5

    5.4

    8.8

    41.2

    5.6

    4.8

    45.2

      (4)0.1mol/L二甲胂酸鈉緩沖液(pH5.07.4

    pH

    0.2mol/L二甲胂酸鈉(ml

    0.2N HCl(ml)

    蒸餾水

    5.0

    25

    23.5

    51.5

    5.2

    25

    22.5

    52.5

    5.4

    25

    21.5

    53.5

    5.6

    25

    19.6

    55.5

    5.8

    25

    17.4

    57.5

    6.0

    25

    14.8

    60.3

    6.2

    25

    11.9

    63.1

    6.4

    25

    9.2

    65.8

    6.6

    25

    6.7

    68.3

    6.8

    25

    4.7

    70.3

    7.0

    25

    3.2

    71.8

    7.2

    25

    2.1

    72.9

    7.4

    25

    1.4

    73.6

      注:HCI可由NCO3代替,配制成二甲胂酸鈉-HNO3緩沖液。

     。50.2mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.210.7

    pH

    0.2mol/L Na2CO3(ml)

    0.2mol/L NaHCO3(ml)

    9.2

    4.0

    46.0

    9.3

    7.5

    42.5

    9.4

    9.5

    40.5

    9.5

    13.0

    37.0

    9.6

    16.0

    34.0

    9.7

    19.5

    30.5

    9.8

    22.0

    28.0

    9.9

    25.0

    25.0

    10.0

    27.5

    22.5

    10.1

    30.0

    20.0

    10.2

    33.0

    17.0

    10.3

    35.5

    14.5

    10.4

    38.5

    11.5

    10.5

    40.5

    9.5

    10.6

    42.5

    7.5

    10.7

    45.0

    5.0

      三、顯色液

      免疫細胞化學中,由于抗原-抗體反應所形成的復合物本身無色,無法直接觀察,因而需借助于某些化學基團的呈色作用,使其得以顯示,以利于在顯微鏡下觀察。常用的顯色液有:

      1DABDiaminobenzidine)顯色液

      DAB3,3-二氨基苯聯胺

      試劑:DAB(常用四鹽酸鹽) 50mg

      0.05mol/L TB        100ml

      30% H2O2         3040μl

      配制方法:先以少量0.05mol/L(pH7.6)TB溶解DAB,然后加入余量TB,充分搖勻,使DAB終濃度為0.05%,過濾后顯色前加入30%H2O23040μl,使其終濃度為0.01%。

      DAB顯色液主要用于免疫過氧化物酶法(如酶標法、PAP法等),其終產物可直接在光鏡下觀察,也可經OsO4處理后,增加反應產物的電子密度,用于電鏡觀察。但有幾點需注意:DAB溶解要完全,否則未溶解的顆粒沉積于標本上影響觀察;DAB濃度不易過高,否則顯色液呈棕色,增加背景染色,另外DAB有致癌作用,故操作時應戴手套,盡量避免與皮膚接觸,用后及時徹底沖洗,接觸DAB的實驗用品最好經洗液浸泡24h后使用。

      24--1-萘酚(4-Cl-1-Naphthol)顯色液

      配方14-Cl-1-萘酚         100mg

      純乙醇               10ml

      0.05mol/L TB(pH7.6)        190ml

      30% H2O2             10μl(0.003%)

      配制方法:先將4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中,然后加入Tb 19ml,用前加入30% H2O2使其終濃度為0.005%,切片顯色時間通常為520min。

      配方24-Cl-1-萘酚

      N-二甲基甲酰胺(DMF

      0.05mol/L TB(pH7.6)

      30% H2O2

      配制方法:先將4-Cl-1-萘酚加入DMF中,加熱溶解使呈乳白色,再加入TB,乳白色變為絮狀,在7.5℃加熱5min后加入H2O2,攪動使絮狀消失,趁熱過濾,當降至略低于50℃時才放入組織標本(注意:溫度過高易損傷標本,過低則易重新出現沉淀)。顯色時間通常為5min左右。

      4-Cl-1-萘酚的終產物顯示藍色。

      多數認為最好去除白色沉淀(如上述),但Larsson等認為,白色沉淀可作為背景,使陽性部位更易觀察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚顯色的組織標本,勿用酒精脫水。

      33-氨基-9-乙基卡唑(3-amino-9-ethylcarbozole,AEC)顯色液

      試劑:AEC           20mg

      二甲基甲酰胺(DMF)      2.5ml

      0.05mol/L醋酸緩沖液(pH5.5)  50ml

      30%H2O2            25ml

      配制方法:先將AEC溶于DMF中,再加入醋酸緩沖液充分混勻。臨顯色前,加入30%H2O2。切片顯色時間為520min。

      該顯色液作用后,陽性部分呈深紅色,加以蘇木精或亮綠等作為背景染色,則效果更佳。由于終產物溶于酒精和水,故需用甘油封固。

      4TMB顯色液

      試劑:TMB

      HCl

      亞硝基鐵氰化鉀

      無水酒精

      配制方法:

     。1)醋酸鹽緩沖液:取1.0mol/LHCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸鈉400ml中混合,再加蒸餾水稀釋至1000ml,用醋酸或NaOHpH調至3.3。

     。2A液:取上述緩沖液5ml,溶解100mg亞硝基鐵氰化鉀,加蒸餾水92.5ml混合。

     。3B液:稱取5mg TMB加入2.5ml無水酒精中,可加熱至37℃40℃直到TMB完全溶解。

     。4)孵育液:放入標本前數秒,取2.5ml B液及97.5ml A溶于試管中充分混合。(液體在20min內應保持清亮的黃綠色,否則可能已有污染)。酶反應時,加入終濃度為0.005%H2O2。

     。5)主要顯色步驟:組織標本在蒸餾水(或PBS)中漂洗數次(每次約1015min)后放入未加H2O2的孵育液中作用20min19℃30℃),然后向孵育液中放入H2O2(每100ml孵育液中加0.3%H2O2 1.05.0ml)繼續孵育液20min左右(19℃23℃),撈出標本漂洗數次(共30min左右)。在04℃條件下可在漂洗液放置4h直至貼片、脫水,封片。也可在貼片前在1%的中性紅中負染23min,也可在1%派諾寧(pH3.33.5)中負染5min后貼片、脫水、封片。

      TMB即四甲基聯苯胺(Tetrabenzidine)是一種脂溶性較強的基團,因此容易進入細胞與細胞器中的HRP反應,且由于這種高度的脂溶性,使其易形成多聚體,在HRP活性部位產生粗大的、深蘭色沉淀物,這使得TMB成為組化實驗中的一種很好的發色團。同時反應產物的沉淀,使得HRP的活性部位更加暴露,利于酶氧化反應進行。TMB的反應產物為深藍色,利于光鏡觀察,且反應產物越聚越大,常超出單個細胞器的范圍(而DAB則被限制在其內),故TMB反應的檢測閾較低。由于上述優點,目前TMB常用于光鏡及超微結構水平的HRPHRP-WGA神經投射的研究。需要注意的是:TMB顯色液中的A液和B液應在2h內新鮮配制。另外,TMB是一種較強的皮膚刺激劑,并有致癌的潛在可能,故使用時應帶手套及在通風條件下操作。

      5NBT顯色液

      試劑A液:5%NBT:稱 取0.5gNBT溶于10ml 70%DMF(二甲基甲胺)內,充分混合,常存于4℃,也可裝成小份,-20℃保存,用前復溫。

      B液:5% BCIP:稱取BCIp 0.5g溶于10ml 100%DMF內,混勻。4℃或分裝存于-20℃,用前恢復至室溫。

      C.顯色液:取A40μl,加入到盛有10ml0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl2)管內,充分混勻;再加入B40μl,輕輕混合即可。最好用前新鮮配制。

      NBT即四唑氮藍(Nitro-Blue-Tetrazolium,MW=818,為深藍色無定形微溶物質。BCIP5--4--3-吲哚-磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)。當二者存在時,在堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP)作用下,NBT被還原形成顯微鏡下可見的藍色或紫色沉淀。

      四、粘附劑

      在免疫細胞化學工作中,由于標本(如切片)的脫落常影響工作的質量的速度,故粘附劑的選擇和使用就顯得較為重要。

      1.鉻礬明膠液

      試劑:鉻礬        0.5g

      明膠(Gelatine)     5g

      H2O           ~1000ml

      方法:在1000ml的燒杯或燒瓶中,以500800ml H2O加溫溶解明膠,待其完全溶解后,再加入鉻礬。注意溫度過高易使明膠燒糊,包被玻片時最好控制水溫在70℃。如有明顯殘渣,過濾后使用。

      2.甲醛-明膠液

      試劑:40%甲醛      2.5ml

      明膠          0.5g

      蒸餾水         至100ml

      配制方法:用少許蒸餾水(約80ml)加熱溶解明膠,待完全溶化后,加入甲醛,最后補充蒸餾水至100ml混勻即可。

      3.多聚賴氨酸(Poly-L-Lycine,PLL

      試劑:多聚賴氧酸      5g

      蒸餾水           ~1000ml

      配制方法:稱取PLL,溶于H2O,充分混合即可,此液濃度為0.5%,可適當稀釋配成0.010.5%濃度。4℃保存,也可-20℃備用。PLL可反復冰凍,效果無明顯影響,工作液常再稀釋1050倍。

      4Vectabond試劑  該試劑是Vector公司新進推出的一種新型玻片粘附劑。該試劑與一般的粘附劑不同,它是通過對玻璃表面起化學修飾作用,改變其表面的化學物理特性,使組織切片牢固地貼于玻璃片上,貼上后不易脫落,保留時間較久。一個試劑盒(7ml)可配成350ml工作液(用丙酮配)。處理載玻片前(事先酸處理),用染色缸裝好各種液體,按下列程序進行:

      干凈載玻片丙酮5min→Vectabond試劑工作液(7ml Vectabond+ 350ml丙酮):將載玻片用鑷子夾住浸入Vectabond試劑12→dH2O,2×5min→干燥(37℃過夜)用鋁箔包好,室溫存放備用。

      注意:避免污染(塵埃等)。

      綜上述方法處理的載片一般可存放半年以上。

      五、封固劑

      1.甘油-TBS及甘油-PBS

      

      配制方法:按比例將甘油和TBS(或PBS)充分混合后,置4℃,冰箱靜止;待氣泡排除后方可使用。

      2.甘油-明膠(凍)

      試劑:明膠     10g

      甘油        12ml

      蒸餾水       100ml

      香草酚       少許

      配制方法:稱取1g明膠于溫熱(約40℃)的蒸餾水中,充分溶解后過濾,再加入12ml甘油混合均勻。少許香草酚是為了防腐。

      3.液體石蠟  液體石蠟因含雜質少,很少引起非特異性熒光,故常用于熒光組化及免疫熒光法時標本的封固。

      4DPX

      試劑:Distrene    10g

      酸二丁        5ml

      二甲苯       35ml

      DPX為中性封固劑,用于多種染色方法勻不易褪色,但組織收縮較明顯,故應盡量使其為均勻的一薄層。DPX現有商品出售,可直接應用。若感過于粘稠,也可加少量二甲苯稀釋后應用。注意:二甲苯不可加得太多,二甲苯揮發后,片子上出現許多干燥的空泡,影響觀察,遇有這種情況,可用二甲苯浸泡掉蓋玻后重新封固。

      六、酶消化液

      10.1%胰蛋白酶

      試劑:胰蛋白酶      0.1gm

      0.1%氯化鈣(pH7.8)   100ml

      配制方法:先配制0.1%CaCl2,0.1mol/LNaOH將其pH調至7.8,然后加入蛋白酶溶解之。用前將胰蛋白酶消化液在水浴中予熱至37℃(載有標本的玻片也在TBS中予熱至同樣樣溫度)。該消化液時間約為530min。

      20.4%胃蛋白酶

      試劑:胃蛋白酶      400mg

      0.1N HCl         100ml

      配制方法:同胰蛋白酶。消化時間在37℃約為30min。

      30.06% Pronase

      試劑:Pronase       0.06g

      0.05mol/L TB(pH7.5)    100ml

      配制方法:同前。

      在免疫細胞化學染色中,有時經Formalin過度固定的標本,常會產生過量的醛基,遮蓋抗原,影響一抗與抗原的結合。用蛋白酶溶液消化,可起到暴露抗原部分的作用。消化時間應根據不同組織而異,總之,在保持組織形態不被破壞的前提下,宜盡量延長消化時間。以上三種酶消化液中,以第一種最為常用。

      七、其它

      1.蔗糖溶液  免疫細胞化學中應用的蔗精,常用濃度為5%30%。一般光鏡研究,僅用20%蔗糖處理已足矣,若制備電鏡標本,在冰凍前最好經上行蔗糖(5%、10%、15%、20%20%蔗糖-5%甘油等)處理,以確保其良好的細微結構。

     。120%蔗糖液:

      試劑:蔗糖           20g

      0.1mol/L PB(pH7.5)       至100ml

      配制方法:先以少許0.1mol/LPB溶解蔗糖,再加0.1mol/l PB100ml充分混合,置4℃冰箱保存。

      該液多用于純光鏡研究。標本在剛放入濃度如此高的蔗糖液,常浮在上面,當標本沉到底部時即可。通常光鏡標本浸泡在20%蔗糖液中過夜。都能達到要求。

     。220%蔗糖-5%甘油:

      試劑:蔗糖       20g

      甘油          5ml

      0.1mol/L PB      至100ml(95ml)

      配制方法:先用少許PB溶解蔗糖后,再加入甘油,充分混勻,最后補足PB100ml,于4℃保存備用。

      該液主要用于電鏡標本的處理,常浸泡過夜(其它濃度的蔗糖中常分別為2h左右)。

      蔗糖是一種廉價的防凍劑,兼有脫水的作用,它可減小標本在冰凍切片時冰晶形成的數量和大小,應用較為方便。若無試劑蔗糖(Sucrose)也可用普通蔗糖(Cane Sugar)。配制好的蔗糖溶液,放置時間超過一個月時,應重新配制。

      2T riton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)  免疫細胞化學中,Triton X-100常用濃度為1%0.3%,但通常是先配制成30%Triton X-100儲備液,臨用時稀釋至所需濃度。

      30% Triton X-100的配制:

      試劑:Triton X-100                 28.2ml

      0.1mol/L PBS(pH7.3)0.05mol/l TBS(pH7.4)      72.8ml

      配制方法:取Triton X-100PBS(或TBS)混合,置37℃40℃水浴中23h,使其充分溶解混勻。用前取該儲備液稀釋至所需濃度。

      Triton X-100是一種非離子型表面活性劑(或稱清潔劑),分子量為646.86C34H62O11)。它能溶解脂質,以增加抗體對細胞膜的通透性。1%Triton X-100常用于漂洗組織標本,0.3%Triton X-100則常用于稀釋血清,配制BSA等。

      3.甲醇-H2O2

      試劑:純甲醇    10ml

      30% H2O2      0.1ml

      配制方法:吸取30%H2O20.1ml,加入100ml純甲醇中,充分混勻即可,使H2O2終濃度為0.3%(也有的用0.03%、0.5%等)。

      甲醇-H2O2處理組織標本,具有封閉內源性過氧化物酶活性的作用,但其具體機制至今仍不詳。通常處理時間在室溫約為530min。注意,用H2O2處理標本,對某些抗原的抗原性有影響,故建議在使用新的抗血清或抗原時,最好同時設立非處理對照組。

      4.常用生理鹽液

    常用生理鹽液的成分(g/1000ml

     

    Kerbs

    Kerbs-Hen-selsit

    Locke

    Tyrode

    Ringer

    NaCl

    5.54

    6.92

    9.00

    8.00

    6.50

    KCl

    0.36

    0.35

    0.42

    0.20

    0.14

    MgCl2

    -

    -

    -

    0.10

    -

    MgSO4·7H2O

    0.29

    0.29

    -

    -

    -

    CaCl2

    0.28

    0.28

    0.24

    0.20

    0.12

    NaH2PO4

    -

    -

    -

    0.05

    0.01

    KH2PO4

    0.16

    0.16

    -

    -

    -

    NaHCO3

    2.10

    2.10

    0.15

    1.00

    0.20

    Glucose

    2.10

    -

    1.00

    1.00

    2.00

    Pyruvic acid

    0.43

    -

    -

    -

    -

    Fumaric acid

    0.62

    -

    -

    -

    -

    Glutamic acid

    0.72

    -

    -

    -

    -

      配制方法:精確稱取各種藥品(如上表),加入500ml重蒸水中,待完全溶解后,補足重蒸水至1000ml,充分混勻即可。

      在免疫細胞化學實驗中,某些物質不宜經固定劑作用或經固定劑作用后仍易丟失,而需浸泡在生理鹽液中。這些生理鹽液的成分與正常哺乳動物血清的成分相似,能使組織離體后能處于盡量接近生理狀態時的環境。Glucose通常是在用前臨時加入。有的(如Kerbs液)在使用時通常需通入含CO2/O22.55%/97.595%的氣體。這些生理鹽液中的CO2和二碳酸鹽,主要起緩沖作用,Glucose主要是提供離
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