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    土壤DNA提取的最佳方案

    2014-12-15 13:40:42      點擊:
    簡介

            土壤宏基因組學技術是近來發展比較迅速的一種新方法,是研究土壤微生物生態學的基礎,也是獲是土壤中各種基因資源的一種有效手段。宏基因組學又叫環境基因組學(Environmental Genomics)或群體基因組學(Community Genomics),定義為利用現代基因組技術直接研究自然狀態環境中的有機體群落,而不需要分離、培養單一種類的微生物。研究環境基因學的前提就是要獲得質量足夠好的DNA,由于土壤微生物往往會與土壤其他組分緊密結合,這就增加了提取土壤DNA的難度。常用的方法包括直接提取法和間接提取法。直接提取法是將樣品直接懸浮在裂解緩沖液中處理,使其釋放DNA,繼而抽提純化;間接提取法是首先去除土壤等雜質,通過不同的離心速度從土壤中分離出細胞,然后對細胞進行抽提。直接提取法提取的DNA片段較。1~50kb),提取率高,操作簡單;間接提取法提取的片斷較大(20~500kb),純度高,但操作繁瑣,有些微生物在分離過程中會丟失得到的DNA并非土壤樣品中的全基因組(宏基因組),目前已經很少研究者會采用這種方法。
            直接法純化土壤DNA最大的難點是如果有效除去與核酸分子非常相似的腐殖酸,因為痕量的腐殖酸的存在對后續的實驗影響嚴重,比如PCR失敗等。傳統的純化方法幾乎不能有效除去腐殖酸,GBCBIO Technologies公司經過技術公關,在如何有效除去腐殖酸等抑制因子上取得重大突破,研發出高效的腐殖酸吸附劑,能夠徹底除去腐殖酸等抑制因子,腐殖酸吸附劑是添加在裂解的過程中,后續的純化采用硅膠柱的方式,因而操作上更簡單,無繁瑣的操作。GBCBIO公司的土壤DNA提取試劑盒能與進口MOBIO公司的相媲美。

    實驗流程:

    1. 0.3-0.5g土壤置于2ml離心管中,加入0.4g Glass Beads,再加入780μl Buffer C1100μl Buffer C2。渦旋器高速震蕩3-5min。

    注意:Buffer C2是我司獨特的腐殖酸除去劑,100μl對大部分樣品來說足以有效除去腐殖酸等抑制因子。對一些腐殖酸含量特別豐富的土壤, Buffer C2的量可以適當增加,但不能超過250μl,否則會嚴重影響DNA的得率。

    2. 加入100μl Buffer C3C3如有沉淀37水浴完全溶解后再用),渦旋混勻。70水浴處理10min。期間振蕩幾次。

    注意:如果要純化革蘭氏陽性菌的DNA,請在70處理完后,再90水浴處理2min。

    3. 12000 rpm(~13000×g)離心1鐘,轉650μl上清到1.5ml離心管中,加入150μl BufferC4混勻。

    4. 冰上放置5min。12000 rpm(~13000×g)離心1鐘。

    5. 轉移上清到新的2ml離心管中,加入0.7倍的異丙醇,顛倒混勻,12000 rpm(~13000×g)離心2鐘。

    注意:如果是DNA含量很低的土壤樣品,建議離心前-20℃放置1小時。

    6.倒掉上清,倒置離心管于吸水紙上30-60秒。加入100μl滅菌去離子水,再加入350μl Buffer C5(必須把Buffer C5混勻后再吸。,渦旋混勻,70水浴放置數分鐘,至沉淀完全溶解即可。

    7. 12000 rpm(~13000×g)離心1鐘,400μl轉移上清到新的1.5ml離心管中,加入150μl無水乙醇,混勻。

    8. 將上一步所得溶液加入到GBC吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12000rpm離心30秒,倒掉濾過液重新套回收集管。

    9. GBC吸附柱中加入500 μl Buffer WB,12,000 rpm (~13,000×g ) 離心30 ,倒掉廢液,將GBC吸附柱放入收集管中。

    10. GBC吸附柱 中加入650 μl DNA Wash Buffer使用前請先檢查是否已加入無水乙醇,12,000 rpm (~13,000×g ) 離心30 秒,倒掉廢液,GBC吸附柱放入收集管中。

    11. GBC吸附柱 中加入650 μl DNA Wash Buffer,12,000 rpm (~13,000×g ) 離心30秒,倒掉廢液,將GBC吸附柱放入收集管中。

    12. 12,000 rpm(~13,000×g)離心分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

    13. GBC吸附柱轉入一個干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位懸空滴加30-100 μl 洗脫緩沖液TE或滅菌去離子水,室溫放置2-5 分鐘,12,000 rpm (~13,400×g ) 離心分鐘,將溶液收集到離心管中。

    注意:為增加基因組DNA的得率,可將離心得到的溶液再加入吸附柱中,室溫放置分鐘,12,000 rpm(~13,400×g )離心分鐘。洗脫緩沖液體積不應少于30 μl,體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應保證其pH 值在7.0-8.5 范圍內(可以用NaOH將水的pH值調到此范圍),pH 值低于7.0 會降低洗脫效率;且DNA 產物應保存在-20,以防DNA 降解。

     

    實驗結果

    腐殖酸吸附劑(Buffer C2)使用效果比較
    在土壤樣品裂解時,比較加與不加Buffer C2的所獲得的裂解液澄清度。從上圖看,加有Buffer C2的樣品,顏色明顯淺很多,說明Buffer C2對出去腐殖酸、色素等效果明顯。
    1,2:裂解時加入Buffer C2
    3,4: 裂解時未加Buffer C2

    裂解液加Buffer C4進一步沉淀除雜效果:
    上一步獲得的裂解液上清加入Buffer C4進一步處理,沉淀離心除雜,裂解時加有Buffer C2(腐殖酸吸附劑)的,再經Buffer C4處理幾乎不再有顏色,而不加Buffer C2的顏色還很深。
    1,2:裂解時加有Buffer C2
    3,4:裂解時不加Buffer C2

     
    1, 2: SDS高鹽酚氯仿抽提法
    3, 4: 使用Soil DNA Kit提取
    1, 3: 為花基土壤
    2, 4: 河邊淤泥
     
    訂購信息 

     D8105

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     50T

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     570.00

    960.00 

     1780.00


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